Los microorganismos: un grupo taxonómico heterogéneo.

Introducción: historia de la microbiología.

Métodos de estudio.

Microorganismos procariotas       

• Bacterias: concepto
• Estructura bacteriana
• Fisiología bacteriana
• Reproducción bacteriana
• Tipos de bacterias, atendiendo a su forma  y a su fisiología (pág.335 y 339).
• Virus: concepto      
• Estructura vírica
• Clasificación
• Ciclos vitales: Ciclo lítico y ciclo lisogénico. Retrovirus

Formas de vida de los microorganismos: patógenos, simbióticos y como agentes biogeoquímicos.  Pág.351-355. Resumen de todo ello.
Los  interesados pueden ampliar o aclarar ideas sobre fisiología bacteriana  leyendo las  pág, 349-355. Simple lectura de los recuadros de las pág.338,339 y 340)

Introducción

Los microorganismos son seres microscópicos. Su tamaño se mide en micras (micrómetro: μm), nanómetro (nm) y el angstrom (Ǻ)

Este pequeño tamaño proporciona a los microorganismos diversas ventajas como:
- Rápido intercambio de sustancias con el medio externo, dado que la disminución del tamaño celular supone un aumento en la relación superficie volumen, lo que facilita dicho intercambio.

- Metabolismo muy rápido pues los compartimentos celulares están muy próximos a los metabolitos y nutrientes. Por ello pueden alterar rápidamente el medio en que viven, agotando los nutrientes e inundándolo de residuos. Las toxinas son productos metabólicos de algunos microorganismos que utilizan como arma de ataque-defensa ante los competidores.

- Rápida multiplicación, basada en su eficaz metabolismo.
Esto tiene aspectos positivos que utiliza la microbiología industrial en la fabricación de antibióticos, fermentaciones etc, y aspectos negativos, especialmente su capacidad invasora, siendo muchos de ellos seres patógenos.

- Pueden adaptarse a todo tipo de condiciones ambientales, por extremas que sean, formando según L. Margulis, una capa continua sobre la Tierra conocida como microcosmos. Por esta capacidad de adaptación y rápido metabolismo los microorganismos desempeñan papeles básicos de los ciclos biogeoquímicos.

Historia de la microbiología

-Desde el Neolítico se preparan yogur, kéfir y queso.
-Los egipcios preparaban pan fermentado, vino y cerveza, así como la salazón.
-La conserva de pescado para aprovechar los excedentes, se considera antiquísima.
-R. Hooke, en 1665, dio nombre a  la célula, y observó algunos microorganismos, mohos que crecen en el cuero.

 
-Las primeras observaciones de microorganismos, las realizó Antony Van Leeuwenhoeck, con descripciones y dibujos que todavía se conservan.

Los microscopios construidos por Leeuwenhoek eran diferentes a los actuales. La lente era única, diminuta y casi esférica (se convirtió en un experto tallando lentes).  La muestra, era colocada en un alfiler y se enfocaba manipulando dos tornillos que variaban de posición el alfiler con respecto a la lente. El observador mantenía el instrumento con su otra cara muy próxima al ojo y miraba oblicuamente a través de la lente. No era posible variar el aumento, aunque se conseguía ver entre 30 y 50 veces más grande. Aunque en su tiempo ya se conocían los microscopios compuestos, de dos lentes, no permitían ver con claridad las bacterias.
Leeuwenhoek se enfrentó a la teoría de la generación espontánea, demostrando que los gorgojos y pulgas no surgían espontáneamente en los granos de trigo, sino que se desarrollaban a partir de huevos diminutos

En el siglo XIX se produce un gran impulso de la Microbiología, por el desarrollo del microscopio y de la manipulación de los microorganismos. A principios del s. XIX se fabrican los primeros microscopios compuestos, con lentes acromáticas que permiten mejorar las observaciones de bacterias.

Se pretende contestar a dos grandes preguntas:
- ¿Existe la generación espontánea?
- ¿Cuál es la causa de las enfermedades contagiosas?

-En 1869 se realizan las primeras tinciones.

-1884 H.C.Gram realiza la famosa tinción que lleva su nombre y que se utiliza para clasificar las bacterias en Gram + y Gram -.

(De S. Poe) IZQUIERDA: bacteria Gram positiva teñida de violeta o púrpura tinción Gram. DERECHA: bacteria Gram negativa teñida de rojo o rosa, después de la coloración de Gram.

-En 1890 se descubren las estructuras flagelares.
-En 1894, la pared celular bacteriana.

  Pasteur y la derrota de la generación espontánea. Las observaciones sobre la putrefacción, que aparecía sin la aparente existencia de seres que la propiciaran, propugnaba que podía surgir materia animada e inanimada, a partir de lo inerte. Sin embargo, con los nuevos avances al examinar este material al microscopio, se veía que estaba lleno de bacterias. ¿De dónde vienen estas bacterias? Algunos pensaban que provenían de semillas o "gérmenes" que llegaban al alimento a través del aire (Teoría de la biogénesis), mientras que otros opinaban que se originaban espontáneamente a partir de material inerte (Teoría de la generación espontánea).

A finales del XIX se conocía la morfología de las bacterias, pero hasta que no se construyeron los microscopios electrónicos, en 1934, no se avanzó mucho más.

1897, Buchner descubrió que la fermentación alcohólica se podía realizar sin levaduras.
1941 Beadle y Tatum asilaron mutantes de la levadura Neurospora crassa.
En 1944 Avery, Mac Leod y McCarty demostraron que la transformación bacteriana está originada por el ADN, que sirvió para reconocer el material genético.
En los años 70, el descubrimiento de la técnica del ADN recombinante ha permitido introducir en microorganismos fragmentos de ADN que codifican la síntesis de proteínas útiles, como la insulina o la hormona del crecimiento. Ha servido para el desarrollo de la Biogenética.

Microscopio electrónico

El microscopio electrónico (1934)

Métodos de estudio de microorganismos

Debido a su pequeño tamaño, se deben estudiar poblaciones. Se necesita  para cultivar los microorganismos.

El estudio de las bacterias se realiza mediante cultivos, que consisten en esencia en extractos nutritivos estériles, ya sean líquidos o sólidos. Los líquidos, preparados en tubos de ensayo debidamente tapados con algodón y esterilizados, suelen ser caldo de carne, suero sanguíneo y sangre, enriquecidos con ciertas sustancias sin las cuales no pueden reproducirse (peptonas, Aa). Los  sólidos se obtienen a partir de los líquidos mediante adición de agar-agar en caliente, luego se vierte sobre tubos de ensayo inclinados o sobre Placas de Petri. Posteriormente se esterilizan, se siembran utilizando el asa de platino y se coloca en la estufa de cultivo, para favorecer su multiplicación.

Cuando los cultivos están compuestos de un solo tipo de organismo, se denomina cultivos puros.
Técnica para la realización de cultivo puro
Como son tan pequeños, no requieren mucho espacio: les basta con una placa de Petri o con un tubo de ensayo, convenientemente esterilizado, libre de otros microorganismos.
-Se introducen los microorganismos y se debe mantener protegido, evitando la contaminación atmosférica.
-Se inoculan los cultivos mediante un asa de cultivo (hilo metálico enrollado, con mango), previamente esterilizado a la llama .Los cultivos se realizan en ambientes esterilizados.

La esterilización
Dejar un objeto libre de todo organismo vivo.
-El calor es el más utilizado: puede ser seco o húmedo.
Los objetos de vidrio y materiales sólidos estables: se calientan en horno a 170º durante 90`
Por calor húmedo se realiza en autoclave, recipiente metálico, que se llena de vapor a P mayor que la atmosférica. Más efectivo, y bastan 20`para esterilizar 3 litros.

Un autoclave utiliza vapor de agua a presión para esterilizar objetos mediante calor. La mayoría de los autoclaves están diseñados de manera que el mismo vapor hace salir el aire de la cámara. En caso contrario, los objetos que quedaran en las bolsas de aire no se esterilizarían. También están equipados con indicadores que comprueban que se alcanza la temperatura precisa y se mantiene durante el tiempo necesario para la esterilización.
-Otro método físico es la filtración, que se realiza para disoluciones termolábiles, con filtros capaces de retener microorganismos, pero no se retienen los virus. Normalmente se utilizan los filtros de membrana,  compuestos de nitrocelulosa, con un poro de 0,45 µm; este tamaño es lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos, con excepción de los virus y algunas bacterias muy pequeñas. La filtración es el método de elección para esterilizar soluciones de vitaminas, antibióticos v otros compuestos termolábiles, que son añadidos a los medios.
-Método químico.  El hipoclorito sódico (lejía doméstica) se utiliza para destruir los cultivos de la mavoria de los microorganismos patógenos, para que no contaminen el medio ambiente. Para esterilizar materiales termolábiles, tales como ropas y contenedores de plástico,  se utiliza óxido de etileno, pero exige muchas precauciones:  se aplica en camaras presurizadas especiales, parecidas a la autoclave.

Los medios de cultivo
Son los materiales preparados para que crezcan los microorganismos.  El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida.  No sólo la falta de nutrientes es problemática, sino que las concentraciones altas pueden resultar tóxicas. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas.
Los nutrientes más necesarios son los que aportan C, N, S y P.
En menos cantidad, aportan K, Mg, Ca, Fe.
En menor cantidad, los oligoelementos: Mn, Co, Cu, Zn, Mo
Las diatomeas requieren Si, las cianofíceas, Na, en fín, que hay mucha variedad.

El aislamiento
En algunos casos para lograr el aislamiento de colonias, se inocula o introduce, una sola célula de un microorganismo en un medio solido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables.
Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Una colonia de bacterias de tamaño medio contiene, aproximadamente, 109 células individuales, casi tantos individuos como personas pueblan la Tierra.
Para aislar células individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran numero en que normalmente están presentes. La dilución se realiza, normalmente, por uno de los siguientes sistemas: siembra por estría en placa, vertido en placa y extensión en placa.
 El método de siembra por estría en placa Es el método más fácil. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población,  se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petrí.  Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales
Los métodos de vertido en placa y extensión en placa Las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa, porque la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.
En el método de la extensión en placa, las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con la avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

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